近年來，CAR-T療法的成功讓人們看到免疫治療的巨大潛力，也成為人類攻克癌癥歷史上的重要里程碑。但目前CAR-T療法主要僅針對血液腫瘤且容易引發(fā)細胞因子風暴，這也促使科研人員開發(fā)更有效的細胞療法，CAR-NK的問世就被視為免疫治療的新一代利器。

所謂CAR-NK細胞治療，是通過基因工程技術將CAR表達于NK細胞表面，賦予和增強NK細胞對腫瘤的靶向殺傷功能。NK細胞屬于固有淋巴細胞家族，存在于人外周血、骨髓和組織器官中，可以通過T細胞受體（TCR）和相關CD3分子的缺失，以及神經(jīng)細胞黏附分子（也稱為CD56）的表達所鑒定。值得慶幸地是，異體來源NK細胞不表達個體特異性TCR，不同于T細胞通過TCR特異性識別MHC—抗原肽復合物產(chǎn)生活化信號進而激活的方式，NK細胞發(fā)揮殺傷靶細胞的作用無須抗原刺激、抗原提呈且無自體MHC限制性，在臨床治療中出現(xiàn)移植物抗宿主病的風險遠低于異體T細胞治療。另外，基于NK細胞的“自我缺失”識別模式，無論是單獨輸注還是聯(lián)合造血干細胞移植，與受者KIR基因不相合的供者NK細胞抗腫瘤作用更強，更適宜被開發(fā)為通用型免疫細胞治療產(chǎn)品，有利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應用。

隨著基因修飾技術的進步，許多方法被用于生產(chǎn)CAR-NK。CAR-NK細胞療法的主要挑戰(zhàn)之一是基因轉移效率低。與其他基因轉移方法相比，逆轉錄病毒轉導用途廣泛，高效且無明顯毒性。具體優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個方面：
一、逆轉錄病毒具有相對中性的整合譜，遺傳毒性較小

臨床應用最常用的逆轉錄病毒載體包括源自人類免疫缺陷病毒-1（慢病毒載體）和莫洛尼鼠白血病病毒（γ逆轉錄病毒載體）的載體。整合組分析表明，γ逆轉錄病毒載體優(yōu)先整合在轉錄起始位點、CpG島和對癌癥有影響的基因附近，而慢病毒載體傾向于整合在主動轉錄的基因中^[1]。相比之下，α逆轉錄病毒載體具有相對中性的整合譜，更有利于應用到臨床研究中^[2]。然而，以前的研究使用攜帶病毒編碼序列和完整長末端重復序列（LTR）的α逆轉錄病毒載體。雖然病毒編碼序列在宿主細胞中具有潛在的免疫原性并增加載體動員的風險，但含有轉錄元件的完整LTR能夠激活細胞基因并有助于插入誘變^[1]。

目前，已開發(fā)了γ和α逆轉錄病毒自失活（SIN）載體，從LTR中去除了增強子和啟動子元件，并建立了一個先進的分裂包裝系統(tǒng)，另外從載體中去除病毒編碼序列和逆轉錄病毒剪接位點，以解決插入式誘變的問題^[6]。此外，通過多種策略，包括刪除自我復制所需的基因以及減少病毒基因組和載體生成細胞的重疊序列，已經(jīng)降低了形成復制能力逆轉錄病毒（RCR）的可能性，這些策略已用于許多臨床研究^[3、4]。
二、逆轉錄病毒轉導NK細胞效率高

幾十年來，逆轉錄病毒一直被用作基因治療載體。NK細胞對逆轉錄病毒轉導的抵抗力的可能解釋可能源于細胞對病毒感染的固有防御機制。提高逆轉錄病毒轉導效率的策略包括用細胞因子（IL-2）和K562細胞預活NK細胞，以表達膜結合的IL-21。逆轉錄病毒載體轉染NK細胞效率為27％-52％，編碼分泌型IL-15或膜結合型IL-15（mIL-15）基因的逆轉錄病毒的轉導效率可達70％^[3]。

不同種類的逆轉錄病毒被用來制備CAR-NK細胞。與γ逆轉錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉錄病毒在原代NK細胞的轉導效率上更高。在不同逆轉錄病毒中，α-逆轉錄病毒載體顯示出比γ-逆轉錄病毒載體更優(yōu)越的性能，在NK細胞系中的轉導效率為90%，在受刺激的原代NK細胞中的轉導效率大于60%。

截止到2021年底，已經(jīng)有20項使用CAR-NK細胞系的研究和15項使用原代NK細胞的研究應用了逆轉錄病毒。另外，最近的一項I期臨床試驗中，由逆轉錄病毒轉導的CD19 CAR-NK細胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。在這項研究中，73%的患者有響應，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內反應迅速。經(jīng)過一年的隨訪，仍然可以檢測到擴增的CAR-NK細胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達一年之久，這些結果首次表明逆轉錄病毒轉導的CAR-NK細胞可以在體內長期存活^[5]。
三、逆轉錄病毒可以通過穩(wěn)定的包裝細胞系達到一致、經(jīng)濟、大規(guī)模的載體生產(chǎn)

隨著越來越多的臨床試驗使用γ逆轉錄和慢病毒載體進行穩(wěn)定基因組修飾的基因治療，對臨床適用的逆轉錄病毒載體批次的需求不斷增加，這表明經(jīng)濟載體生產(chǎn)對未來基因治療試驗的重要性。與瞬時轉染相比，使用穩(wěn)定的包裝細胞系有望實現(xiàn)一致、經(jīng)濟、大規(guī)模的載體生產(chǎn)，從而有可能治療更多的患者。

逆轉錄病毒獨特的復制能力允許轉基因穩(wěn)定地整合到目標基因組并長期表達CAR，但只能在分裂的NK細胞中表達。一般來說，逆轉錄病毒載體可以通過瞬時轉染或穩(wěn)定的包裝細胞系產(chǎn)生。這兩種方法在建立、靈活性、可重復性、擴大可能性和質量保證方面具有明顯的優(yōu)缺點。對于瞬時生產(chǎn)，將包裝系統(tǒng)的所有組件以質粒的形式瞬時遞送到包裝細胞中。這允許靈活地改變載體成分。相比之下，建立穩(wěn)定的包裝細胞系需要將所有組件穩(wěn)定地整合到產(chǎn)生病毒的包裝細胞系的基因組中，雖然前期工作需要較為耗時，且需要進行技術平臺的搭建及活化。但是通過穩(wěn)定的包裝細胞系生成病毒載體可以高水平在保證批次間產(chǎn)品一致性，而瞬時產(chǎn)生的病毒顆粒則受到顯著波動的影響。由于要達到生產(chǎn)規(guī)范（GMP）級質粒，瞬時轉染生產(chǎn)過程的升級成本高昂且技術要求很高。所以，從監(jiān)管、生產(chǎn)相關以及經(jīng)濟角度來看，通過穩(wěn)定的包裝細胞系生成病毒載體是首選^[4]。
四、逆轉錄病毒可以通過假分型增強對NK細胞的基因轉移效率
逆轉錄病毒假分型是指在病毒載體上摻入來自其他包膜病毒的糖蛋白，允許逆轉錄病毒載體轉導更廣泛的細胞和組織。增強 NK 細胞轉導的一種方法是選擇最佳假型包膜蛋白。目前。已有研究結果提出了使用RD114-TR假型逆轉錄病毒顆粒與Vectofusin-1結合使用作為對PBMC來源的NK細胞進行基因修飾以高產(chǎn)量獲得高細胞毒性CD19-CAR-NK細胞的成功策略，并且α逆轉錄病毒轉導的CAR-NK細胞比慢病毒轉導的CAR-NK細胞具有更高的細胞毒性^[6]。有研究認為在α和γ逆轉錄病毒環(huán)境中，RD114 / TR假型病毒顆粒的基因轉移水平高于VSVg假型病毒顆粒。這種轉導效果可能部分是由于中性氨基酸轉運蛋白2（ASCT-2，SLC1A5）的表達，RD114/TR利用該轉運蛋白進入細胞。使用RD114 / TR假型α逆轉錄病毒顆粒與Retronectin介導的轉導相結合，可在NKL細胞系中穩(wěn)定轉導水平超過90%，在原代NK細胞中穩(wěn)定轉導水平高達60%^[2]。

參考文獻

[1] Suerth, Julia D et al. “Alpharetroviral vectors: from a cancer-causing agent to a useful tool for human gene therapy.” Viruses vol. 6,12 4811-38. 5 Dec. 2014, doi:10.3390/v6124811

[2]Suerth, J.D., Morgan, M.A., Kloess, S. et al. Efficient generation of gene-modified human natural killer cells via alpharetroviral vectors. J Mol Med 94, 83–93 (2016).

[3]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[4]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[5]Franks SE, Wolfson B, Hodge JW. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131. doi: 10.3390/cancers12082131.

[6]Müller, Stephan et al. “High Cytotoxic Efficiency of Lentivirally and Alpharetrovirally Engineered CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cells Against Acute Lymphoblastic Leukemia.” Frontiers in immunology vol. 10 3123. 24 Jan. 2020, doi:10.3389/fimmu.2019.03123

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